台南大天后宫起源于明郑时期，郑成功(1624-1662)迎明太祖宗室后裔宁靖王朱术桂(1617-1683)于金门厦门为郑军之监军，以表郑成功军队行动皆有明皇室的允许。郑成功之子郑经(1642-1681)接位之后为巩固正统性，迎接宁靖王来台，并令部将在承天府(赤崁楼)旁兴建郡王府。永历37年(公元1683年)，清军攻陷澎湖之后，宁靖王决心殉死，自缢前捐献宅邸予佛祖为寺庙，称「东宁天妃宫」。清军统率，水师提督施琅(1621-1696)在此地接受郑克塽(1670-1707)投降，并在康熙23年(公元1683年)上疏请康熙皇帝准许加封妈祖为「天妃」来崇拜奉祀，改造这座王府为妈祖宫庙。康熙59年(公元1720年)，翰林徐葆光(1671-1723)出使琉球归来，为感谢妈祖保佑而上奏，使得天后宫被纳入国家春秋两季祀典，成为台湾最早的官建祀典妈祖庙。自此正式改称「大天后宫」，民间俗称为「大妈祖庙」。雍正年间，获得皇帝赐匾，各方官员来台都会到大天后宫参拜致意。乾隆年间，陆续有增补修建，乾隆30年(公元1765年)知府蒋允焄(生卒年不详)重修，并为方便来致祭的文武官员更衣，增建正殿后方官厅。
嘉庆23年3月16日(公元1818年4月20日)清晨，大天后宫发生火灾，损失相当巨大，中殿及后殿都焚毁，只剩大门。其中神像、及牌位皆烧毁无存，住持僧人所储蓄的银钱全都镕化。
嘉庆年间的大火后产生两大改变：其一，由于重建的经费，主要由府城三大商业公会「府城三郊」募款集资，至道光10年(公元1830年)完成重建时，大天后宫的庙务，已由过往佛教僧侣为住持、清政府主事，转变为府城地方有力商会主导。另外，在火灾之后，大天后宫由于神像已烧失，祭典期间需要其他庙宇协助，后来的「府城迎妈祖」祭仪，可能就源于这段期间向北港朝天宫迎神像来协助祭典进行而开始。
清末马关条约割让台湾予日本之后，台湾成立「台湾民主国」，驻防台南府的总兵刘永福(1837-1917)被推举为第2任总统时，曾利用大天后宫后进侧边的箱房为办公室。日军进府城，政权更替之后，大天后宫庙方一度与由日本来的曹洞宗僧侣合作，曹洞宗并以大天后宫为传教据点，但在明治31年(公元1898年)台湾总督府禁止台湾寺庙成为日本寺庙分寺之后，庙务又回到原本三郊商会为主导。
大正4年(公元1915年)开始，府城迎妈祖的活动发生与北港朝天宫争执，自此不再以从北港迎来的妈祖像，改以大天后宫内的神像绕境。大正15年(公元1926年)的妈祖绕境因与台南运河开通典礼同时进行，不仅台南市各庙宇及民间团体参与，日本政府甚至让地方各派出所一同加入协办。声势极大，民间甚至产生「台南妈祖开运河」之说。
虽然如此，大天后宫在日治时代一度陷入被标售的处境，起因为总督府推行「皇民化运动」，于昭和12年(公元1937年)更由地方政府主导「寺庙整理运动」，企图透过整理、裁并地方寺庙来压制台湾传统的宗教。台南大天后宫的庙产丰厚，台南州政府为寻觅财源，决定废除大天后宫，标售庙产充抵社会事业费用。在政府主导下，主事商会组织「三郊组合」在昭和15年(公元1940年)底决议将三郊产业移交给日本政府台南州厅。而台南州厅又将三郊产业移交给「台南商工会议所」(即今台南市商业会前身)。商工会取得三郊名下产业后，决定拍卖包括大天后宫在内的多笔产业。这引起地方信众极力反对，当时台北帝大土俗人种学讲座讲师宫本延人(1901-1987)兼任台湾总督府文教局调查官，到台南调查时，有信徒告知大天后宫面临标售拆除的危机。宫本延人遂介入斡旋，出面前往与台南州知事沟通，终取消标售案。因此义举，宫本延人受到台南民众的感念，他赠予大天后宫的匾额，今日与帝王显贵们的题字一同悬挂于大天后宫横梁上。
二次大战后，大天后宫本身也历经多次重建，其中较主要改建者包括民国48至49年(公元1959至1960年)将三川门由单檐改成假四垂屋顶，以及民国60年(公元1971年)将官厅改为三宝殿。
民国74年(公元1985年)8月19日政府公告大天后宫为台闽地区第1级古迹。确立大天后宫特出的历史地位。民国76年(公元1987年)，北港朝天宫举行环岛祈安活动，再次与大天后宫接触并恢复旧谊。而在民国93年(公元2004年)发生了正殿居中位民间俗称「大妈」的大妈祖像崩裂事件，一时震惊全台。详情是6月11日凌晨庙方人员开庙门时，发现正殿的大妈金身从胸部以上裂开并断落地面，头部、双手裂成两截，所幸结构仍完整、脸庞稍损。后续调查判定原因是神像内部木材支柱腐朽。在匠师、学者、及富经验的日籍佛像修护专家等通力合作之下，完成的新大妈祖像，为金面妈祖，此为庙方据宫志记载要求修复。于民国95年(公元2006年)举行了重新开光的安座典礼。
今日大天后宫仍为台南最重要的庙宇之一，每逢庆典由地方首长甚或总统南下亲自主持祭礼。
大天后宫由于居于台湾早期政治中心地，许多文物与建筑在在见证台湾历史发展。从方位上，大天后宫就有其历史特殊，不同于其他汉人宫庙多座北朝南，大天后宫方位是座东朝西。因为原本为宁静王府，故门开面向西边，是望向中国大陆故土之意。各方文物中，除了拜殿内悬挂的超过20方历代皇帝、首长赠匾之外，「平台纪略碑记」在康熙22年(公元1683年)由施琅所立，记录将台湾收入清朝版图的经过，是台湾现存年代最早的清碑。
庙址在创建之时本临码头边，建于斜坡地上，因此建筑物由前而后，级级升高，从庙宇前埕到正殿处共高出17阶。自前殿、拜殿、正殿至后殿，一进比一进雄伟。而大天后宫崇祀的神明，也正反映其作为港边的庙宇。
拥有四进，宽达三开面的大天后宫，拜殿的屋架构造以桁木与接榫交错迭合多达10层，这个支撑屋顶的结构称为「十架卷棚栋架」的大木结构，为现存台湾庙宇中所仅见。
大天后宫的古迹石刻龍柱、龍虎堵墙面、门箱、石阶梯等构件。另还依循左龍右虎，左琴棋、右书画图像排序。所用石头，大部分属于台湾清领时期的上等石料，即由福建泉州府惠安所产的耐风化侵蚀之花岗岩石材如泉州白石、青斗石、砻石等，因其质地坚硬不易风化，又耐酸碱的特性，所以让大天后宫裡多數的石刻装饰迄今仍保存良好，图像清楚可見，十分珍贵。大天后宫的石刻大多成形于清朝年间，制作匠师因为不像绘画装饰上有画师落款题名，在清末前的石刻装饰作者多已不可考，而如三川门现存的精美石刻装饰，据记载大部分是大正3年(公元1914年)由福建惠安的蒋氏匠师一门所刻制。
门前的1对抱鼓石，上作阴刻螺旋纹，下方双面各作不同花鸟祥瑞图像装饰，刻画有玉蘭花树、双锦鸡等图像。双鸟作一静一动或走动之姿，体态生动自然。2个抱鼓石面中央处则刻有相同的4只蝙蝠展翅作于4边，围绕着中心处的吉祥花草，四蝠有传统谐音的「赐福」之意。门2边相对空间的对看堵上刻的图像，多有对照的吉祥寓意，例如代表着长寿吉祥的鹿与鹤动物；与花中之王的牡丹花、鸟中之王的凤鸟与苍鹰立于鳌鱼之上，都有独特与拔得头筹的隐喻含于其中。于水車堵的石刻构件，有将军举长戢，童子骑象举磬牌与另边的将军举大旗，童子骑瑞兽举彩球。也是双呼应的吉祥意像。拜殿与主殿裡的2对龍柱，设置于清領时期，拜殿所立龍柱，柱头装饰有上下覆盆蓮花，单龍绕柱，龍身尾上身下，身有飘云，一足握珠，足下踏浪，猛然扭头曲胸向上，颇有力量。整体造型流畅，雕法古拙，风格不尚虚饰。正殿龍柱比拜殿龍柱时期略早，上方有木头延伸支撑，设立时应该不是立于目前位置。其为泉州砻石所刻制，为单龍盘旋柱身而上，比起拜殿的龙柱，造型雕刻则更为突出显得立体，其龍头更加上昂，张大口似吼，更显气势不凡。石刻整体可見以建筑结构与装饰艺术结合，雕工精致，线条顺畅圆滑。
大天后宫重要的壁画装饰有多幅国宝级匠师潘丽水(1914-1995)、陈玉峰(1900-1964)的作品，现存之29幅壁画皆由陈氏、潘氏2家族执笔所绘制，其后虽经其他画师重新修整摹绘，但是仍尊其原作由嫡传弟子丁清石(？-2004)、陈寿彝(1934-2012)等人所完成，承袭原来的画风与技法。壁画装饰集中于室内的建筑空间，例如三川殿以及过水廊道、拜殿、主殿、父母殿，与大雄宝殿的三宝殿及走廊、观音殿等处之墙壁。大天后宫裡壁画所绘的内容主要以道教、佛教、崇天思想等，并以人的故事为主，其中包含了源自传统文化的忠君爱国、禮义孝悌之類的歷史故事与民间传說。神龛边亦有许多精致的吉祥装饰，皆极具艺术价值。
大天后宫创立初期为天妃庙，即是妈祖庙。这个信仰并没有因为清军到来而改变，反而加强。因为施琅攻台更一再强调其过程中蒙妈祖保佑才顺利登陆，更奏请皇帝崇祀妈祖。尔后清朝主事官员又登大天后宫为官方正式祭典的庙宇并数次修庙。此实因对于临台江内海府城内熙熙攘攘的诸多生民，无论渡海来到台湾讨生计的开垦者、出海捕鱼的渔夫、或者3大商会「三郊」之中靠着跨越海峡两岸贸易营生的商人，海上平安实在至关重要。
所以正殿中主祀的也多为相关的神明。除了居中的妈祖以外，右边神龛的乃是四海龙王；左边神龛读是水仙尊王。皆是护佑航海安全的神明。
后殿的奉祀则具历史意义。后殿原为宁静王府的后厅，即日常起居空间。清代改建为妈祖庙之后，此处奉祀妈祖父母。现今则还奉祀宁靖王和大天后宫开山住持圣知和尚。宁静王殉死前捐献此宅予圣知和尚为庙，宁静王今被崇敬为大天后宫的「檀越主」，即施主。
大天后宫居于台湾早期政治中心地，许多文物与建筑在在见证台湾历史发展，具有独特历史地位，历代名人所贡献的匾额更不胜枚举。
进入正殿，两侧墙壁各自书写「忠孝」、「节义」共4字。
正殿中主祀除了居中的妈祖以外，右边神龛为四海龙王；左边神龛为水仙尊王，皆是护佑航海安全的神明。