清朝水师提督施琅（公元1621年-1696年）收復臺湾后封为「靖海侯」，清康熙24年(公元1685年)立「平臺纪略碑记」，略记平臺经过、安抚措施与善后处理等内容，凋工精细，是全臺地区最早的清代碑碣，现位于大殿左侧，深具历史价值。
通常一般的庙宇大门不会使用门钉，只有皇宫或供奉帝后级诸神的官庙才使用。因此臺湾一般妈祖庙多使用彩绘门神，但大天后宫红色的大门是饰以门钉72颗，彰显祀典官庙及妈祖崇高神格。
大天后宫正殿臺基立面共嵌有4件螭首(螭相传为龙的九子其中之一，通常刻于钟鼎、印章、碑首、石阶、石柱等处，在建筑中多用在排水口装饰)石刻，龙头的造型微微抬高、气宇轩昂，是中国传统建筑石作制度中的殿阶螭首，深具宫殿威仪的象徵，这项装饰为全臺妈祖庙中仅有。
大天后宫内壁画彩绘遍佈，集历来一流名师作品。从三川殿延伸至后殿两旁，皆为国宝级彩绘大师等人作品，包括潘丽水(公元1914年-1995年)、潘岳雄(公元1943年-)父子，和陈玉峰（公元1900年-1964年）、陈寿彝(（公元1934年-2012年）父子，以及丁清石(生年不详-2004年)，内容皆为中国传统民间传说、神话故事、书法等。彩绘自日治时期开始，分6次绘製、重绘或重修： 1、昭和18年(公元1943年)陈玉峰在正殿、正殿前后廊口，以及圣父母厅后廊口的龙虎壁上作品。 2、民国45年(公元1956年)陈玉峰又在三川殿、庑廊、拜殿再画12堵。 3、民国60年(公元1971年)重修圣父母厅与改建更衣亭成偏殿中的三宝殿，由潘丽水在圣父母厅中虎边绘「花木兰」，三宝殿神龛两侧各画一扇三夹木板画。 4、民国67年(公元1976年)陈寿彝以临摹原作方式，重绘父亲陈玉峰在大天后宫拜殿与正殿最早的作品。 5、民国69年(公元1980年)由丁清石重修，彷写陈玉峰在1956年的作品。 6、民国86年(公元1997年)由潘岳雄復原缺失部分。
大天后宫承续传统寺庙建筑的木架构，拜殿是臺湾最高大的捲棚式屋架，捲棚为中国古代建筑屋顶形式之一，即两坡相交处成弧形弯曲，无明显屋嵴，不用一钉而拱起，充分发挥传统建筑力学。
大天后宫因「祀典」的地位，珍藏超过上百面的古匾额，在目前悬挂的清代历代皇帝御赐匾额中，雍正皇帝所赐「神昭海表」、咸丰皇帝的「德侔厚载」及光绪皇帝的「与天同功」最为珍贵。
正殿尺寸硕大的金面妈祖神像高约5.45公尺，为明代神像的造型，已有约3百多年历史，民国93年（公元2004年）因泥塑神像内部木材支柱腐朽金身一度破裂受损，修復期间在神像内发现3块清代石牌，内容记载神像曾于道光2年（公元1822年）修復，且妈祖神像为金面。因后来神像被香火燻黑，最后修復时，再将其恢復原貌。随侍两侧的千里眼、顺风耳将军凋像，则是肌肉线条逼真，威勐慑人，亦为清代时期作品。
臺湾俗语「三月疯妈祖」遶境盛况科仪，起源于臺南祀典大天后宫，自清乾隆时期主持庙务的三郊集团，藉妈祖信仰分香，团结各地郊商联络情谊，形成府城迎妈祖的历史。清朝时期遶境活动是云林北港妈祖到臺南8天7夜行程，护送者多达数十万人。日治时期大正4年(公元1915年)改由臺南「镇南妈」本地妈祖遶境，后因昭和12年(公元1937年)中日战争爆发停止活动。二战(公元1945年)后又因政治形势影响并未每年举行，迄今仍为每4年1科(4年1次)，每逢农曆鼠年、龙年、猴年举办遶境2天，日期在妈祖圣诞前一个月，每次参与活动庙宇均多达数十家，出动的神轿及阵头多达上百阵，是臺湾目前阵容最大的遶境科仪。