圣母庙占地40公顷，庙殿建坪达2万馀坪，共分南北向四进(就是坐北朝南，前后共有大门及3个殿)，两侧以厢房迴廊相接，上复琉璃瓦簷饰相连，计有五王殿、妈祖殿、佛祖殿、大士殿、天公殿等，各殿中央空间均挑高数层，中有8大红柱，形成高大特殊的现代庙宇风格。四周并有护濠围绕，彷北京紫禁城的建筑，整座庙宇宛如古代宫殿再现，前所未见的巍峨庙殿，为全世界建筑规模最大的妈祖庙。
奉祀的镇殿大妈和二妈为软身妈祖(即神像身体是由木头为骨架撑起)，高度约等同真人，全身未使用一根钉子，属早期中国「榫接」木造工艺技术的极致表现，其中镇殿大妈髮髻后分开双梳，中间有一下垂的梳束，信众如瞻仰庄严法像，圣母宛若微笑回视、栩栩如生，经艺术史家鑑定神像约为明朝（公元1368年-1644年）的作品。
月下老人为「媒神」(专管男女婚姻媒合的幸运之神)，人称月老，相传冥冥之中利用一条红线，将男女双方绑住(牵红线)以结合良缘。据传说臺南正统鹿耳门圣母庙月老非常灵验，来此祈缘并结成连理的新人超过2万多对，在后殿走廊楼梯间鸳鸯谱上挂满了见证的夫妻结婚小卡。
臺南正统鹿耳门圣母庙以「土城香醮(俗称：刈香，又称「割香」，就是神明乞取香火之意)」，于民国102年(公元2013年)获臺南市政府公告为无形的文化资产。而土城香醮阵头中的蜈蜙阵，更是庙方和地方结合最典型的代表。蜈蚣阵民间说法中，认为具有驱邪、祛灾保境、开路解厄的法力，因此蜈蜙头、蜈蜙尾都供在臺南正统鹿耳门圣母庙佛祖殿的神龛内，出巡前3天才迎回组装。一个蜈蜙阵需要36个人，而且以儿童为主，服装需各自製作，相互比较下，也出现愈来愈华丽现象，成为青草里蜈蜙阵最大特色。
清道光11年（公元1831年）臺南正统鹿耳门圣母庙旁曾文溪氾滥，原庙殿遭洪水浸蚀，庙基倾圯庙牆龟裂，三郊公局与鹿耳门村信众为护庙遂立「箕水豹」神碑于庙埕藉以镇水，并举行祭溪仪式，「箕水豹」源自道教天上28星宿中的「箕宿」，因属水、图腾为豹故称之。石碑反映了道教镇水仪式并记录古庙遭逢水灾的历史，后来因庙宇倾颓，石碑亦埋入土中。民国88年(公元1999年) 庙方挖掘鹿耳门圣母庙古庙遗址时石碑重见天日，出土处也是臺南正统鹿耳门圣母庙与鹿耳门天后宫的共同发源处。