臺南大天后宮起源於明鄭時期，鄭成功(1624-1662)迎明太祖宗室後裔寧靖王朱術桂(1617-1683)於金門廈門為鄭軍之監軍，以表鄭成功軍隊行動皆有明皇室的允許。鄭成功之子鄭經(1642-1681)接位之後為鞏固正統性，迎接寧靖王來臺，並令部將在承天府(赤崁樓)旁興建郡王府。永曆37年(公元1683年)，清軍攻陷澎湖之後，寧靖王決心殉死，自縊前捐獻宅邸予佛祖為寺廟，稱「東寧天妃宮」。清軍統率，水師提督施琅(1621-1696)在此地接受鄭克塽(1670-1707)投降，並在康熙23年(公元1683年)上疏請康熙皇帝准許加封媽祖為「天妃」來崇拜奉祀，改造這座王府為媽祖宮廟。康熙59年(公元1720年)，翰林徐葆光(1671-1723)出使琉球歸來，為感謝媽祖保佑而上奏，使得天后宮被納入國家春秋兩季祀典，成為臺灣最早的官建祀典媽祖廟。自此正式改稱「大天后宮」，民間俗稱為「大媽祖廟」。雍正年間，獲得皇帝賜匾，各方官員來臺都會到大天后宮參拜致意。乾隆年間，陸續有增補修建，乾隆30年(公元1765年)知府蔣允焄(生卒年不詳)重修，並為方便來致祭的文武官員更衣，增建正殿後方官廳。
嘉慶23年3月16日(公元1818年4月20日)清晨，大天后宮發生火災，損失相當巨大，中殿及後殿都焚毀，只剩大門。其中神像、及牌位皆燒毀無存，住持僧人所儲蓄的銀錢全都鎔化。
嘉慶年間的大火後產生兩大改變：其一，由於重建的經費，主要由府城三大商業公會「府城三郊」募款集資，至道光10年(公元1830年)完成重建時，大天后宮的廟務，已由過往佛教僧侶為住持、清政府主事，轉變為府城地方有力商會主導。另外，在火災之後，大天后宮由於神像已燒失，祭典期間需要其他廟宇協助，後來的「府城迎媽祖」祭儀，可能就源於這段期間向北港朝天宮迎神像來協助祭典進行而開始。
清末馬關條約割讓臺灣予日本之後，臺灣成立「臺灣民主國」，駐防臺南府的總兵劉永福(1837-1917)被推舉為第2任總統時，曾利用大天后宮後進側邊的箱房為辦公室。日軍進府城，政權更替之後，大天后宮廟方一度與由日本來的曹洞宗僧侶合作，曹洞宗並以大天后宮為傳教據點，但在明治31年(公元1898年)臺灣總督府禁止臺灣寺廟成為日本寺廟分寺之後，廟務又回到原本三郊商會為主導。
大正4年(公元1915年)開始，府城迎媽祖的活動發生與北港朝天宮爭執，自此不再以從北港迎來的媽祖像，改以大天后宮內的神像繞境。大正15年(公元1926年)的媽祖繞境因與臺南運河開通典禮同時進行，不僅臺南市各廟宇及民間團體參與，日本政府甚至讓地方各派出所一同加入協辦。聲勢極大，民間甚至產生「臺南媽祖開運河」之說。
雖然如此，大天后宮在日治時代一度陷入被標售的處境，起因為總督府推行「皇民化運動」，於昭和12年(公元1937年)更由地方政府主導「寺廟整理運動」，企圖透過整理、裁併地方寺廟來壓制臺灣傳統的宗教。臺南大天后宮的廟產豐厚，臺南州政府為尋覓財源，決定廢除大天后宮，標售廟產充抵社會事業費用。在政府主導下，主事商會組織「三郊組合」在昭和15年(公元1940年)底決議將三郊產業移交給日本政府臺南州廳。而臺南州廳又將三郊產業移交給「臺南商工會議所」(即今臺南市商業會前身)。商工會取得三郊名下產業後，決定拍賣包括大天后宮在內的多筆產業。這引起地方信眾極力反對，當時臺北帝大土俗人種學講座講師宮本延人(1901-1987)兼任臺灣總督府文教局調查官，到臺南調查時，有信徒告知大天后宮面臨標售拆除的危機。宮本延人遂介入斡旋，出面前往與臺南州知事溝通，終取消標售案。因此義舉，宮本延人受到臺南民眾的感念，他贈予大天后宮的匾額，今日與帝王顯貴們的題字一同懸掛於大天后宮橫樑上。
二次大戰後，大天后宮本身也歷經多次重建，其中較主要改建者包括民國48至49年(公元1959至1960年)將三川門由單簷改成假四垂屋頂，以及民國60年(公元1971年)將官廳改為三寶殿。
民國74年(公元1985年)8月19日政府公告大天后宮為臺閩地區第1級古蹟。確立大天后宮特出的歷史地位。民國76年(公元1987年)，北港朝天宮舉行環島祈安活動，再次與大天后宮接觸並恢復舊誼。而在民國93年(公元2004年)發生了正殿居中位民間俗稱「大媽」的大媽祖像崩裂事件，一時震驚全臺。詳情是6月11日凌晨廟方人員開廟門時，發現正殿的大媽金身從胸部以上裂開並斷落地面，頭部、雙手裂成兩截，所幸結構仍完整、臉龐稍損。後續調查判定原因是神像內部木材支柱腐朽。在匠師、學者、及富經驗的日籍佛像修護專家等通力合作之下，完成的新大媽祖像，為金面媽祖，此為廟方據宮誌記載要求修復。於民國95年(公元2006年)舉行了重新開光的安座典禮。
今日大天后宮仍為臺南最重要的廟宇之一，每逢慶典由地方首長甚或總統南下親自主持祭禮。
大天后宮由於居於臺灣早期政治中心地，許多文物與建築在在見證臺灣歷史發展。從方位上，大天后宮就有其歷史特殊，不同於其他漢人宮廟多座北朝南，大天后宮方位是座東朝西。因為原本為寧靜王府，故門開面向西邊，是望向中國大陸故土之意。各方文物中，除了拜殿內懸掛的超過20方歷代皇帝、首長贈匾之外，「平臺紀略碑記」在康熙22年(公元1683年)由施琅所立，記錄將臺灣收入清朝版圖的經過，是臺灣現存年代最早的清碑。
廟址在創建之時本臨碼頭邊，建於斜坡地上，因此建築物由前而後，級級升高，從廟宇前埕到正殿處共高出17階。自前殿、拜殿、正殿至後殿，一進比一進雄偉。而大天后宮崇祀的神明，也正反映其作為港邊的廟宇。
擁有四進，寬達三開面的大天后宮，拜殿的屋架構造以桁木與接榫交錯疊合多達10層，這個支撐屋頂的結構稱為「十架捲棚棟架」的大木結構，為現存臺灣廟宇中所僅見。
大天后宮的古蹟石刻龍柱、龍虎堵牆面、門箱、石階梯等構件。另還依循左龍右虎，左琴棋、右書畫圖像排序。所用石頭，大部分屬於臺灣清領時期的上等石料，即由福建泉州府惠安所產的耐風化侵蝕之花崗岩石材如泉州白石、青斗石、礱石等，因其質地堅硬不易風化，又耐酸鹼的特性，所以讓大天后宮裡多數的石刻裝飾迄今仍保存良好，圖像清楚可見，十分珍貴。大天后宮的石刻大多成形於清朝年間，製作匠師因為不像繪畫裝飾上有畫師落款題名，在清末前的石刻裝飾作者多已不可考，而如三川門現存的精美石刻裝飾，據記載大部分是大正3年(公元1914年)由福建惠安的蔣氏匠師一門所刻製。
門前的1對抱鼓石，上作陰刻螺旋紋，下方雙面各作不同花鳥祥瑞圖像裝飾，刻畫有玉蘭花樹、雙錦雞等圖像。雙鳥作一靜一動或走動之姿，體態生動自然。2個抱鼓石面中央處則刻有相同的4隻蝙蝠展翅作於4邊，圍繞著中心處的吉祥花草，四蝠有傳統諧音的「賜福」之意。門2邊相對空間的對看堵上刻的圖像，多有對照的吉祥寓意，例如代表著長壽吉祥的鹿與鶴動物；與花中之王的牡丹花、鳥中之王的鳳鳥與蒼鷹立於鰲魚之上，都有獨特與拔得頭籌的隱喻含於其中。於水車堵的石刻構件，有將軍舉長戢，童子騎象舉磬牌與另邊的將軍舉大旗，童子騎瑞獸舉彩球。也是雙呼應的吉祥意像。拜殿與主殿裡的2對龍柱，設置於清領時期，拜殿所立龍柱，柱頭裝飾有上下覆盆蓮花，單龍繞柱，龍身尾上身下，身有飄雲，一足握珠，足下踏浪，猛然扭頭曲胸向上，頗有力量。整體造型流暢，雕法古拙，風格不尚虛飾。正殿龍柱比拜殿龍柱時期略早，上方有木頭延伸支撐，設立時應該不是立於目前位置。其為泉州礱石所刻製，為單龍盤旋柱身而上，比起拜殿的龍柱，造型雕刻則更為突出顯得立體，其龍頭更加上昂，張大口似吼，更顯氣勢不凡。石刻整體可見以建築結構與裝飾藝術結合，雕工精緻，線條順暢圓滑。
大天后宮重要的壁畫裝飾有多幅國寶級匠師潘麗水(1914-1995)、陳玉峰(1900-1964)的作品，現存之29幅壁畫皆由陳氏、潘氏2家族執筆所繪製，其後雖經其他畫師重新修整摹繪，但是仍尊其原作由嫡傳弟子丁清石(？-2004)、陳壽彝(1934-2012)等人所完成，承襲原來的畫風與技法。壁畫裝飾集中於室內的建築空間，例如三川殿以及過水廊道、拜殿、主殿、父母殿，與大雄寶殿的三寶殿及走廊、觀音殿等處之牆壁。大天后宮裡壁畫所繪的內容主要以道教、佛教、崇天思想等，並以人的故事為主，其中包含了源自傳統文化的忠君愛國、禮義孝悌之類的歷史故事與民間傳說。神龕邊亦有許多精緻的吉祥裝飾，皆極具藝術價值。
大天后宮創立初期為天妃廟，即是媽祖廟。這個信仰並沒有因為清軍到來而改變，反而加強。因為施琅攻臺更一再強調其過程中蒙媽祖保佑才順利登陸，更奏請皇帝崇祀媽祖。爾後清朝主事官員又登大天后宮為官方正式祭典的廟宇並數次修廟。此實因對於臨臺江內海府城內熙熙攘攘的諸多生民，無論渡海來到臺灣討生計的開墾者、出海捕魚的漁夫、或者3大商會「三郊」之中靠著跨越海峽兩岸貿易營生的商人，海上平安實在至關重要。
所以正殿中主祀的也多為相關的神明。除了居中的媽祖以外，右邊神龕的乃是四海龍王；左邊神龕讀是水仙尊王。皆是護祐航海安全的神明。
後殿的奉祀則具歷史意義。後殿原為寧靜王府的後廳，即日常起居空間。清代改建為媽祖廟之後，此處奉祀媽祖父母，現今則還奉祀寧靖王和大天后宮開山住持聖知和尚。寧靜王殉死前捐獻此宅予聖知和尚為廟，寧靜王今被崇敬為大天后宮的「檀越主」，即施主，後殿右側供奉有福德正神、月老公，左側為註生娘娘及臨水夫人，為為臺南四大月老廟之一，求姻緣者絡繹不絕。
大天后宮居於臺灣早期政治中心地，許多文物與建築在在見證臺灣歷史發展，具有獨特歷史地位，歷代名人所貢獻的匾額更不勝枚舉。
進入正殿，兩側牆壁各自書寫「忠孝」、「節義」共4字。
正殿中主祀除了居中的媽祖以外，右邊神龕為四海龍王；左邊神龕為水仙尊王，皆是護祐航海安全的神明。