依據文化資產保存法(中華民國71年5月26日總統令公佈)第27條評定之具歷史、文化、藝術價值；重要歷史事件或人物之關係；具稀少性，不易再現者。
五妃廟原稱「五烈墓」、「寧靖王從死五妃墓」，位於今臺南市中西區。五妃是指追隨明寧靖王朱術桂(1617-1683)殉死的5位妃妾：姬妾袁氏、王氏，和媵妾秀姑、梅姐、荷姐。寧靖王是明太祖朱元璋第15子的後代，南明最後1位稱帝的永曆帝被清政府殺死之後，永曆17年(公元1662年)，鄭成功(1624-1662)之子鄭經(1642-1681)迎接最後的明皇室後裔寧靖王來臺灣，在承天府府署旁建寧靖王府(今大天后宮)。寧靖王雖然為明王室之尊，又居監軍，但個性謹慎持重，怕鋒芒太過，生活簡樸，自請往府城南方的萬年州竹滬莊(今高雄市路竹區)一帶開墾自力更生墾拓田園。元配羅氏過世之後，更深居簡出。
明永曆37年(公元1683年)，清政府派靖海候施琅(1621-1696)攻打臺灣，6月清軍攻下澎湖，即將大舉攻往臺灣。當時寧靖王得知鄭克塽(1670-1707)準備向清軍議和投降，寧靖王以為義不可辱，為了避免受俘虜後在敵人手中遭羞辱，決心一死殉國。寧靖王向長年伴隨身邊的五位姬妾話別並告知她們可以離去，但5位姬妾卻決意尋死，她們先於寧靖王自縊，寧靖王親為這五妃辦理後事，安葬她們在府城南邊的魁斗山的後面。將王印信交給鄭克塽，拜辭天地祖宗，與前來送別的故舊道別，並特意燒毀田契，將萬年州數十甲的田地送給佃農們之後，在王府大堂留下辭世絕命詩「艱辛避海外，總為幾莖髮；於今事畢矣，祖宗應容納。」懸樑而死(《臺灣府志‧卷十二》有云：「妾媵五棺，埋於魁斗山」)。2位侍從也殉死於一旁。10日後，人們將寧靖王遺體運至萬年州與元配羅氏合葬於棚仔林(於今高雄市湖內區)。
五妃墓址原稱為魁斗山，因為魁桂音近，所以許多詩人墨客皆 取諧音而稱為桂子山，且因過去附近到處是一片荒蕪，羊腸小徑，蔓草雜生，罕有人跡，因此也被人依另諧音稱為鬼仔山。原來魁斗山上的五妃墓只是簡單的塚，不特別立建物或植栽，入清數十年後才有墓碑。廟為清乾隆11年(公元1746年)巡臺御史六十七(生卒年不詳)與范咸(生卒年不詳)兩人，命臺灣府海防補盜同知方邦基(?-1750)整地，並在墓塚前面起建廟宇祭祀，同時在旁修建義靈君祠祭拜隨寧靜王而死的2位侍從，故此地後來稱為「五妃廟」。乾隆39年(公元1774年)刊行，臺灣知府余文儀(?-1782)之主修之《續修臺灣府志‧卷十九‧雜記》提到五妃墓「在仁和里。前明寧靖王妃妾，詳〈寧靖傳〉。墓前有碑曰『寧靖王從死五妃墓』。乾隆11年，兩巡院命司馬方邦基重修，且立碑於南門外，曰『五妃墓道』)
日治時於昭和2年(公元1927年)大幅整修，現今所見的樣貌、規模大致為此次整修後的結果。當時的臺南州知事喜多孝治(1878-1934)手撰「五妃之碑」、「弔五妃墓」詩及跋這座石碑現在仍保存於廟旁。民國87年(公元1998年)再度修建。
五妃廟座西南朝東北，是1座「單進兩護龍式」建築，即進正殿前有拜亭，而兩側另建有房間的建築，造型簡潔，色彩十分端重。 布局上一大特色是因其本為墳墓，後建廟宇，所以是「墓廟合一」形式的陰廟。墓塚之前即為廟宇，兩者緊密相連，而「寧靖王從死五妃墓」就在直接鑲刻於廟內神像背後的牆面上，作為墓碑。正殿屋下橫於上的木楹有8根，與一般廟宇使用奇數楹架不同，乃遵守「陽廟以奇數，陰廟以偶數」的漢人民間習俗。
正殿為單開間，供奉五妃神像，用硬山式的燕尾翹脊屋頂。正殿前立四柱歇山馬背式屋頂的拜亭，安彩繪門神的門扇4樘，做為廟的總出入口。五妃因為后妃神格而得配享隨侍太監與宮女，故門神彩繪別具風格，太監平捧牡丹表示獻花富貴、鼎爐表示獻香與薪傳。門的左右，紅色的院牆連接著五百兩護龍的山牆面，與三弧形的馬背屋脊構成高低起伏的外觀。其他同樣單一主殿廟宇建築，廟門開設在正殿；而五妃廟雖僅有單殿，但卻附有拜亭，廟門又在拜亭屋簷下偏內側，使廟門兩旁的牆壁微微傾斜如「八」字。為一大特色。五妃廟歷史已超過300年，園區內許多參天古木及蕭瑟青竹，散發出淡淡的思古幽情，分外令人流連忘返。
五妃廟一特別之處在於不同於漢人傳統的陰陽廟宇區分。一般供奉鬼魂的祠廟概稱為「陰廟」，因其相較一般廟宇所奉祀的神明而言，並沒有經過正式封神、也不是道教天仙，由來大多是無人奉祀的無緣鬼魂，人們憐憫其無人奉祀，因此建祠祭拜，使之有所依歸。五妃廟在大分類上原應屬陰廟。但五妃也不屬未嫁姑娘，不是陰廟中「姑娘廟」類型；不是未知身分的亡者，亦非「大眾廟」類型，更特殊的是由官方起建廟宇來奉祀，且園地又甚寬廣，綠茵處處空氣舒暢。整體觀之，難落入民間陰廟範疇。
五妃的事蹟淒美，壯烈貞節的德性又為傳統所歌頌，故歷來感動許多文人墨客發為詠嘆。在文學史上亦相當重要。今傳最早的詩作即出自於清朝倡議建廟的巡臺御史六十七與范咸，憑弔五妃壯烈的事蹟的詩作石碑今存於臺南市的南門碑林。日後諸多文人如丘逢甲、連橫、梁啟超等人皆曾深受感動做詩文弔唁。
五妃因為后妃神格而得配享隨侍太監與宮女，故門神彩繪別具風格，太監平捧牡丹表示獻花富貴、鼎爐表示獻香與薪傳。
單開問的正殿內，供奉著五妃神像，後方即為「寧靖王從死五妃墓」墓碑。
五妃墓塚與廟宇兩者緊密相連，而墓碑「寧靖王從死五妃墓」就鑲刻於廟內神像背後牆面。