清朝水師提督施琅（公元1621年-1696年）收復臺灣後封為「靖海侯」，清康熙24年(公元1685年)立「平臺紀略碑記」，略記平臺經過、安撫措施與善後處理等內容，雕工精細，是全臺地區最早的清代碑碣，現位於大殿左側，深具歷史價值。
通常一般的廟宇大門不會使用門釘，只有皇宮或供奉帝后級諸神的官廟才使用。因此臺灣一般媽祖廟多使用彩繪門神，但大天后宮紅色的大門是飾以門釘72顆，彰顯祀典官廟及媽祖崇高神格。
大天后宮正殿臺基立面共嵌有4件螭首(螭相傳為龍的九子其中之一，通常刻於鐘鼎、印章、碑首、石階、石柱等處，在建築中多用在排水口裝飾)石刻，龍頭的造型微微抬高、氣宇軒昂，是中國傳統建築石作制度中的殿階螭首，深具宮殿威儀的象徵，這項裝飾為全臺媽祖廟中僅有。
大天后宮內壁畫彩繪遍佈，集歷來一流名師作品。從三川殿延伸至後殿兩旁，皆為國寶級彩繪大師等人作品，包括潘麗水(公元1914年-1995年)、潘岳雄(公元1943年-)父子，和陳玉峰（公元1900年-1964年）、陳壽彝(（公元1934年-2012年）父子，以及丁清石(生年不詳-2004年)，內容皆為中國傳統民間傳說、神話故事、書法等。彩繪自日治時期開始，分6次繪製、重繪或重修： 1、昭和18年(公元1943年)陳玉峰在正殿、正殿前後廊口，以及聖父母廳後廊口的龍虎壁上作品。 2、民國45年(公元1956年)陳玉峰又在三川殿、廡廊、拜殿再畫12堵。 3、民國60年(公元1971年)重修聖父母廳與改建更衣亭成偏殿中的三寶殿，由潘麗水在聖父母廳中虎邊繪「花木蘭」，三寶殿神龕兩側各畫一扇三夾木板畫。 4、民國67年(公元1976年)陳壽彝以臨摹原作方式，重繪父親陳玉峰在大天后宮拜殿與正殿最早的作品。 5、民國69年(公元1980年)由丁清石重修，仿寫陳玉峰在1956年的作品。 6、民國86年(公元1997年)由潘岳雄復原缺失部分。
大天后宮承續傳統寺廟建築的木架構，拜殿是臺灣最高大的捲棚式屋架，捲棚為中國古代建築屋頂形式之一，即兩坡相交處成弧形彎曲，無明顯屋脊，不用一釘而拱起，充分發揮傳統建築力學。
大天后宮因「祀典」的地位，珍藏超過上百面的古匾額，在目前懸掛的清代歷代皇帝御賜匾額中，雍正皇帝所賜「神昭海表」、咸豐皇帝的「德侔厚載」及光緒皇帝的「與天同功」最為珍貴。
正殿尺寸碩大的金面媽祖神像高約5.45公尺，為明代神像的造型，已有約3百多年歷史，民國93年（公元2004年）因泥塑神像內部木材支柱腐朽金身一度破裂受損，修復期間在神像內發現3塊清代石牌，內容記載神像曾於道光2年（公元1822年）修復，且媽祖神像為金面。因後來神像被香火燻黑，最後修復時，再將其恢復原貌。隨侍兩側的千里眼、順風耳將軍雕像，則是肌肉線條逼真，威猛懾人，亦為清代時期作品。
臺灣俗語「三月瘋媽祖」遶境盛況科儀，起源於臺南祀典大天后宮，自清乾隆時期主持廟務的三郊集團，藉媽祖信仰分香，團結各地郊商聯絡情誼，形成府城迎媽祖的歷史。清朝時期遶境活動是雲林北港媽祖到臺南8天7夜行程，護送者多達數十萬人。日治時期大正4年(公元1915年)改由臺南「鎮南媽」本地媽祖遶境，後因昭和12年(公元1937年)中日戰爭爆發停止活動。二戰(公元1945年)後又因政治形勢影響並未每年舉行，迄今仍為每4年1科(4年1次)，每逢農曆鼠年、龍年、猴年舉辦遶境2天，日期在媽祖聖誕前一個月，每次參與活動廟宇均多達數十家，出動的神轎及陣頭多達上百陣，是臺灣目前陣容最大的遶境科儀。