聖母廟占地40公頃,廟殿建坪達2萬餘坪,共分南北向四進(就是坐北朝南,前後共有大門及3個殿),兩側以廂房迴廊相接,上覆琉璃瓦簷飾相連,計有五王殿、媽祖殿、佛祖殿、大士殿、天公殿等,各殿中央空間均挑高數層,中有8大紅柱,形成高大特殊的現代廟宇風格。四周並有護濠圍繞,仿北京紫禁城的建築,整座廟宇宛如古代宮殿再現,前所未見的巍峨廟殿,為全世界建築規模最大的媽祖廟。
奉祀的鎮殿大媽和二媽為軟身媽祖(即神像身體是由木頭為骨架撐起),高度約等同真人,全身未使用一根釘子,屬早期中國「榫接」木造工藝技術的極致表現,其中鎮殿大媽髮髻後分開雙梳,中間有一下垂的梳束,信眾如瞻仰莊嚴法像,聖母宛若微笑回視、栩栩如生,經藝術史家鑑定神像約為明朝(公元1368年-1644年)的作品。
月下老人為「媒神」(專管男女婚姻媒合的幸運之神),人稱月老,相傳冥冥之中利用一條紅線,將男女雙方綁住(牽紅線)以結合良緣。據傳說臺南正統鹿耳門聖母廟月老非常靈驗,來此祈緣並結成連理的新人超過2萬多對,在後殿走廊樓梯間鴛鴦譜上掛滿了見證的夫妻結婚小卡。
臺南正統鹿耳門聖母廟以「土城香醮(俗稱:刈香,又稱「割香」,就是神明乞取香火之意)」,於民國102年(公元2013年)獲臺南市政府公告為無形的文化資產。而土城香醮陣頭中的蜈蜙陣,更是廟方和地方結合最典型的代表。蜈蚣陣民間說法中,認為具有驅邪、祛災保境、開路解厄的法力,因此蜈蜙頭、蜈蜙尾都供在臺南正統鹿耳門聖母廟佛祖殿的神龕內,出巡前3天才迎回組裝。一個蜈蜙陣需要36個人,而且以兒童為主,服裝需各自製作,相互比較下,也出現愈來愈華麗現象,成為青草里蜈蜙陣最大特色。
清道光11年(公元1831年)臺南正統鹿耳門聖母廟旁曾文溪氾濫,原廟殿遭洪水浸蝕,廟基傾圯廟牆龜裂,三郊公局與鹿耳門村信眾為護廟遂立「箕水豹」神碑於廟埕藉以鎮水,並舉行祭溪儀式,「箕水豹」源自道教天上28星宿中的「箕宿」,因屬水、圖騰為豹故稱之。石碑反映了道教鎮水儀式並記錄古廟遭逢水災的歷史,後來因廟宇傾頹,石碑亦埋入土中。民國88年(公元1999年) 廟方挖掘鹿耳門聖母廟古廟遺址時石碑重見天日,出土處也是臺南正統鹿耳門聖母廟與鹿耳門天后宮的共同發源處。